提高顯微鏡的分辨率

顯微鏡作為檢測設(shè)備的主要設(shè)備之一，而評判顯微鏡性能的重要指標(biāo)是分辨率。分辨率是指能清楚地分辨兩個小點或兩線間的最小距離。人眼本身就是一臺顯微鏡，在標(biāo)準(zhǔn)照明條件下，人眼在明視距離（國際公認為25cm） 上的分辨率約等于1/ 10mm。對于觀察兩條直線來說，由于直線能刺激一系列神經(jīng)細胞，眼睛的分辨率還能提高一些。

人眼的分辨率只有1/ 10mm， 那么比1/ 10mm 小的物體或比1/ 10mm 近的兩個微小物體的距離，人眼就無法分辨了。所以出現(xiàn)了從簡單的宏觀放大鏡到微觀觀測的光學(xué)顯微鏡，繼而電子顯微鏡。顯微鏡的分辨率定義是指在標(biāo)本上能清楚分辨的兩個小點之間的最小距離。其計算公式為：

D=0.61λ／NA

式中：D 為分辨率（um）；λ 為光源波長（um）；NA 為物鏡的數(shù)值口徑（也稱鏡口率）。

由公式可得到，顯微鏡的分辨率決定于入射光源的波長以及所匹配物鏡的數(shù)值孔徑。由此可知，提高光學(xué)顯微鏡的方法：

1、降低光源波長。

可見光最短波長為390nm,若用此波長的紫外光作為照明光源，可使光學(xué)顯微鏡的分辨率降低至0.2um。但是由于大多數(shù)普通材料的玻璃會大量吸收340nm以下波長的光，紫外光經(jīng)過大量衰減無法形成清晰、明亮的圖像。因此不得不使用石英(可透過低達200nm的紫外光)、熒石(可透過低達185nm的紫外光)等價格昂貴的材料，并且紫外光顯微鏡不能用肉眼進行觀察，甚至受觀測樣品的限制，再加上昂貴的造價，所以這種提高顯微鏡分辨率的方式由于其自身的局限性而不受廣泛應(yīng)用。

2、增加物鏡的數(shù)值孔徑NA.

數(shù)值孔徑NA=n*sin(u)

式中，n為物鏡與標(biāo)本之間的介質(zhì)折射率；u為物鏡的二分之一孔徑角。因此，從光學(xué)設(shè)計上適當(dāng)采用較大的孔徑角，或者增大折射率成為最常見的提高光學(xué)顯微鏡分辨率的方法。一般低倍物鏡如10X以下其介質(zhì)采用空氣，折射率為1，即干燥系物鏡；水浸介質(zhì)是蒸餾水，其折射率為1.33；油浸物鏡介質(zhì)是香柏油或其它透明油，其折射率一般在1.52 左右，接近透鏡和載玻片的折光率，如Olympus 的100X油鏡。水浸物鏡和油浸物鏡不僅放大倍數(shù)高而且由于使用高折射率的介質(zhì)，從而提高物鏡的分辨率。